测量钙与收缩力的最佳方法(2/3)—数据采集

测量钙与收缩力的最佳方法(2/3)

使用 Fura-2 测量细胞内钙以及原代心肌细胞和 iPSC-CM 收缩能力的最佳方法。

导言
精确评估心肌细胞中的钙处理和收缩力对于理解心脏生理和发病机制至关重要。要获得可靠的结果，必须正确制备样本并获取准确的数据。本应用说明介绍了利用 IonOptix 系统评估原代心肌细胞和 iPSC-CM 中钙处理和收缩性时，针对这两个方面建议的最佳技术。

数据采集

a. 优化荧光光源

虽然 IonOptix 系统在安装时已经校准，但在不同条件下进行的实验可能需要进行调整，特别是光源和 MyoPacer（前面已经讨论过）。本节将重点介绍荧光光源的优化。

在处理装有 Fura-2 的平板时，为了获得最佳结果，建议将分子（钙结合Fura-2）和分母（无钙 Fura-2）原始计数的背景荧光（平板内视野中没有细胞的选定区域）的光强度控制在 200-500 au。同样，对于染色 Fura-2 的细胞，分子和分母原始计数的基线荧光值最好保持在背景信号的 10 倍。确保分子和分母值在基线（静息钙水平）时相当，就能得到接近 1 的钙比值。有关基线（突出显示部分）的说明，请参阅所提供的图片。有关如何调整荧光强度以获得最佳结果的进一步说明，请参阅资源库中的 "优化荧光信号质量 "应用说明。

图 3: 优化荧光。
染色Fura-2 的细胞应显示出大约 10倍于背景的基线信号（基线用蓝色标出）。

b. 为收缩力测量选择合适的 ROI

原代心肌细胞：

IonOptix 使用两种不同的方法分析原代心肌细胞的收缩力：肌节长度和边缘检测算法。肌节长度可直接评估细胞收缩单位（肌节）的长度，而边缘检测则可追踪收缩过程中细胞边缘的移动。虽然肌节长度更能准确评估收缩能力，但这两种技术都需要对每个软件工具进行精确校准。为了帮助在原代心肌细胞中选择合适的 ROI，建议将它们稀疏地放置在预先涂好涂层的玻璃底板上。

肌节长度Sarcomere length:

在定位感兴趣区 (ROI) 时，必须尽量减少图像边缘的变形或弯曲。这可以通过将尽可能多的细胞纳入 IonWizard 肉节长度窗口的紫色方框或多细胞窗口的橙色方框来实现。此外，重要的是要调整焦距，直到两条绿线之间的单个红色峰值清晰可见，并确保左侧绿线位于单个红色峰值旁边。

图4:肌节长测量。
IonWizard 的肌节长度界面允许用户定位 ROI 并优化FFT 质量。

从相邻或重叠的单元格中采集数据，导致两个单元格共享同一个感兴趣区（ROI），这是数据采集中常见的错误。在收缩过程中，由于快速傅立叶变换（FFT）在每个肌细胞之间交替进行，这可能会导致信号不稳定和产生噪音。在这种情况下获得的数据不应使用。如果您使用的是我们的自动细胞分析工具（CytoSolver 3.0），此类数据将被剔除，通常会标注 "最大衍射极限 "错误。
因此，请始终确保 ROI 和视场只包含一个细胞。有关 FFT 和肌节长度算法的详细信息，请参阅我们的应用说明 "SarcLen 和FFT"。(https://www.ionoptix.com/resource/sarclen-ffts/)

边缘检测Edge detection:

选择合适的单元格边界需要遵循某些一般原则。这些原则包括确保准确捕捉两个边缘，以获得细胞尺寸的准确测量值。此外，控制左侧、右侧或两侧边缘的阈值对于避免包含背景噪声或伪影的区域至关重要，因为这可能会影响算法的准确性。最后，应排除图像中可见的任何相邻细胞。

iPSC-CM:

开发 CytoMotion 软件是为了解决 iPSC-CMs 分析中的困难，尤其是检测清晰边缘或肌节的困难。与检测肌节长度和边缘的算法类似，在使用 CytoMotion 时，选择适当的感兴趣区（ROI）至关重要。

iPSC-CMs 成簇，选择收缩中心明确的区域，并将其置于 IonWizard 紫色方框或 MultiCell 窗口橙色方框的中间。
iPSC-CM 单层细胞，任何区域都可以，因为整个板会同时收缩。

在 CytoMotion 中，iPSC-CMs 的收缩能力是通过像素强度和像素相关性来测量的。为确保精确测量，必须在细胞静止时捕获每个 ROI 的参考帧。使用CytoMotion Lite 或我们的传统钙离子和收缩力系统时，可在采集过程中通过选择 IonWizard 中的 "Capture"手动完成。

使用 MultiCell Lite 或 MultiCell HTS 时，会自动选择参考框架。

观察像素强度和像素相关性数据的方向，是确保为选定的 ROI 捕捉到正确参考帧的方法之一。当 iPSC-CM 收缩时，您应该能看到像素强度从基线上升，像素相关性从基线下降。

图 6: 正确与不正确的参考帧捕捉。
收缩时像素强度数据应上升，而像素相关性数据则下降。如果两者相反，则重新捕捉参考帧。

c. 为钙测量选择合适的光圈

实验开始时，将装有 Fura-2 细胞的平板放在显微镜平台上，用适当的激发波长（340 nm和 385 nm）进行激发。这将激发整个平板上所有装有 Fura-2 的细胞。为防止出现伪影，必须将原代心肌细胞或 iPSC-CMs* 的单个细胞团的孔径限制在一个范围内。

控制光圈大小的方法取决于所使用的 IonOptix 系统。对于传统的钙离子和收缩力系统，可通过移动位于细胞取景适配器（CFA）和显微镜相机侧端口之间的光圈旋钮来手动调节光圈，更多信息请参阅 CFA 手册。 (https://www.ionoptix.com/resource/cfa-hardware-manual/).

而在安装 MultiCell HTS 和 MultiCell Lite 时，孔径大小是预先配置好的。孔径大小在 MultiCell 屏幕上以蓝色圆圈显示，请参考下图。在孔径中只包含一个原代心肌细胞或 iPSC-CM 细胞团对收集钙信号至关重要。因此，在平板上保持低密度细胞不仅对正常收缩力至关重要，对准确测量钙离子也很重要。. 如果不调整孔径，可能会导致将多个细胞的钙信号错误地归因于单个细胞。

* 如果使用单层细胞进行实验，则在所有可比实验中都要保持一致的孔径大小。